氏 名 石崎 摩美
生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）は下垂体からの生殖腺刺激ホルモン分泌を促進するホルモンとして発見されたが、これに関与する視索前野GnRH系の他にも複数のGnRH系が脊椎動物の脳内に存在することが近年の研究から明らかになってきている。その一つである終神経GnRH系のニューロンは正中隆起には投射しておらず、生殖線刺激ホルモンの放出には直接関わっていない。これまでの形態学的・生理学的知見から、終神経GnRHニューロンは脳全体に軸索を伸ばし、他のニューロンの興奮性や神経伝達物質の放出などを調節する神経修飾系として働いていると考えられている。そのような神経修飾作用はGnRHニューロンからのGnRH分泌を介して行われていると考えられるが、終神経GnRH系の分泌活動についてはこれまで調べられていない。また、視索前野GnRH系の分泌活動と終神経GnRH系のGnRH分泌活動との違いも明らかではない。そこで本研究では、脊椎動物においてGnRHニューロンの解析に最も適した実験系の一つである淡水産熱帯魚ドワーフグーラミー（Colisa
lalia）の脳を用いて実験を行った。まず、脳・下垂体スライス標本からのGnRH放出をラジオイムノアッセイ（RIA）で測定し、両GnRH系の分泌活動の違いを明らかにした。また終神経GnRH細胞の電気的活動とGnRH分泌活動の関係について考察した。さらに、微小炭素繊維電極を作製してGnRHを電気化学的に測定する方法を開発し、この方法を用いて、脳・下垂体スライスにおける視索前野GnRHニューロン軸索終末領域から、ホルモン分泌活動のリアルタイム記録を行った。
第１章 終神経GnRH系と視策前野GnRH系のGnRH分泌活動の測定
終神経GnRH系と視索前野GnRH系のGnRH分泌活動の違いを調べるために、脳・下垂体スライス標本からのGnRH放出を測定し、GnRH分泌量の雌雄差などの点において両GnRH系で違いがあることを明らかにした。
まずドワーフグーラミーの脳・下垂体矢状断スライス標本を作製し、視索前野・下垂体を含む部分（視索前野GnRHニューロンの細胞体とその投射領域）と、それ以外の部分（終神経GnRHニューロンの細胞体とその投射領域の大部分）の２つに切り分けた（図１）。次にそれぞれをリンガー溶液中で培養し、その後培養液をアゴニスト等が含まれている溶液に替えて一定時間おき、回収した培養液中のGnRH量をRIAで測定した。
高K+溶液で10分間脱分極刺激を行った結果、視索前野GnRH系を含むスライスからのGnRH放出量には雌雄差があり、雄の方が雌よりも多くのGnRHを分泌していることが分かった。一方、終神経GnRH系を含むスライスからのGnRH放出には雌雄差が少なかった(図2)。脱分極刺激によるGnRH分泌は外液Ca2+依存的であったことから、カルシウムチャネルの関与が予想されたのでその型を検討した。Nifedipine,
w-Conotoxin, w-Agatoxin（それぞれL-type, N-type, P/Q-typeのカルシウムチャネルの阻害剤）を投与して高K+脱分極刺激を行った結果、視索前野GnRH系を含むスライスではN-typeのカルシウムチャネルが関与しており、終神経GnRH系を含むスライスでも主にN-typeが関わっているがそれに加えてL-typeも少し関与していることが示唆された。どちらのスライスでもP/Q-typeのカルシウムチャネル阻害剤はGnRH分泌を阻害しなかった。興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸を投与した結果、どちらのGnRH系を含むスライスでもグルタミン酸濃度依存的にGnRH分泌量が増加する傾向がみられた。また、終神経GnRH細胞のパッチクランプによる電流固定法の実験から、同程度の濃度のグルタミン酸によってGnRH細胞の自発的規則発火頻度が上昇することも明らかになった。以上の結果から、終神経GnRHニューロンではグルタミン酸の入力を受けて脱分極がおこり、主に電位依存性Ｎ-typeカルシウムチャネルが開いてCa2+が流入し、それによってGnRH分泌が起こると推測することができる。
次に細胞内カルシウムストアのGnRH放出への関与について調べた。細胞内カルシウムストアからのCa2+放出を促進するためにカフェインを投与した結果、視索前野GnRH系を含むスライス・終神経GnRH系を含むスライスのいずれも、カフェイン投与によりGnRH放出量が自発放出に比べて有意に増加することはなかった。しかし、細胞内カルシウムストアへのCa2+取り込みを阻害するThapsigarginを投与すると、終神経GnRHを含むスライスでGnRH分泌量が減少した。Thapsigargin感受性のカルシウムストアが自発的GnRH分泌に関わっている可能性もあるが、さらなる検討が必要である。また、カルシウムストアの枯渇によって引き起こされる細胞外からのカルシウム流入（容量性カルシウム流入）がGnRH分泌活動にどう関わっているか検討するために、外液Ca2+のない状態で細胞内カルシウムストアを枯渇させておき、その後外液Ca2+を再導入することによって容量性カルシウム流入を起こさせて、その時のGnRH分泌量の変化を調べた。その結果、終神経GnRH系を含むスライスでは、容量性カルシウム流入がGnRH分泌に寄与していることが示唆された。以上の結果から、終神経GnRH系の自発的GnRH放出には、細胞内カルシウムストアとストアへCa2+を補充する役割を持つ容量性カルシウム流入が関わっている可能性が考えられる。
第２章 視索前野GnRH系の分泌活動のリアルタイム記録
微小炭素繊維電極を用いた電気化学的方法により、ドーパミンなどのカテコールアミン類やセロトニンなど酸化還元されやすい神経伝達物質の放出を培養細胞等においてリアルタイムに記録することが最近可能になった。GnRHは酸化されやすいアミノ酸であるTrp、Tyrを含むペプチドなので、微小炭素繊維電極を用いてGnRH分泌活動のリアルタイム記録ができると考えた。そこで、微小炭素繊維電極を自作してGnRH溶液の電気化学的測定を行った。その結果、微小炭素繊維電極の電極電位をおよそ600-800mV以上にすればGnRHの酸化電流を測定できることが分かった。このことから、微小炭素繊維電極の電極電位を800mV以上に保持することにより、脳･下垂体の局所的な場所からのGnRH分泌を記録することができると考えられた。
この方法を利用して、ドワーフグーラミー矢状断脳スライス標本の下垂体における視索前野GnRHニューロンの軸索終末付近からの分泌活動のリアルタイム記録を行った(図3)。下垂体断面における視索前野GnRHニューロンの軸索終末が密集している場所に、微小炭素繊維電極を接触させて電極電位を900mVに保持した。高K+灌流液で脱分極刺激をすると、分泌活動を反映する酸化電流がK+濃度依存的に観測された。このとき電極電位を異なる値に保持して、同様に脱分極刺激を行い酸化電流を記録すると、600mV以下の電極電位では酸化電流は観測されなかったことから、この酸化電流はドーパミンやセロトニンなどの神経伝達物質の酸化電流ではないことが明らかである。ＲＩＡの結果と併せ、微小炭素繊維電極を用いて、スライス標本からGnRHニューロンの分泌活動をリアルタイムに記録できることが示唆された。この方法は、GnRHを分泌する脳内の領域や細胞からの局所的なGnRH放出のリアルタイム測定に応用することができ、GnRH系の機能を解析する有効な手段になると考えられる。
